Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-4126
Authors: Kaps, Leonard
Title: In vivo gene silencing in the liver with siRNA loaded non-biodegradable and biodegradable cationic nanohydrogel particles for antifibrotic therapy
Online publication date: 20-Jan-2018
Year of first publication: 2018
Language: english
Abstract: Cationic nanohydrogel particles are interesting vehicles for systemic siRNA delivery. For the first time, optimized anti-procollagen α1(I) siRNA loaded cationic nanohydrogel particles were tested in vivo as an antifibrotic therapy in a mouse model of liver fibrosis, induced by oral gavage of CCl4. After thorough validation of siRNA loaded nanohydrogel particles in vitro for cell toxicity, cellular uptake and knockdown performance, particles qualified for further biological evaluation in vivo. After systemic administration, siRNA loaded particles almost exclusively accumulated in liver, while lungs, spleen and kidneys were only targeted to a minor extend. On the cellular level, complexes addressed primarily activated myofibroblasts, the major collagen producing cells in liver fibrosis, and to a lesser extend endothelial cells and macrophages. Anti-procollagen α1(I) siRNA loaded cationic nanohydrogel sequence specifically and significantly suppressed hepatic procollagen α1(I) transcript levels and total collagen accumulation in liver fibrotic mice. Furthermore, a significant reduction of α-SMA, a surrogate marker of myofibroblast activation, supported the potent antifibrotic effect of the anti-procollagen α1(I) siRNA/nanoparticle treatment. Thus, cationic nanohydrogel particles qualified as promising vehicle platform for siRNA delivery to nonparenchymal liver cells. Since these first generation cationic nanohydrogel particles proved to be an attractive tool for systemic siRNA delivery, we attempted to improve their in vivo degradability and thus tolerability. This improvement is desirable, especially to prevent potential long-term side effects by tissue and cellular accumulation. A second generation of novel nanohydrogel particles was generated that contained a cationic biodegradable acid-labile cross-linker, endowing the next generation of nanohydrogel particles with enhanced biodegradability (bioNP). The first generation (non-bioNP) were compared 1:1 vs. the second generation cationic nanohydrogel particles (bioNP), loaded with anti-procollagen α1(I) siRNA, in another set of liver fibrosis studies. In vitro, acid-labile biodegradable complexes loaded with anti-procollagen α1(I) siRNA could compete with non-biodegradable complexes and showed no cytotoxicity (up to 400 nM siRNA), high cellular uptake (~100% after 24h) and an even improved knockdown efficiency for procollagen 1α(I) transcript mRNA (up to 80% for bioNP or 60% for non-bioNP) in murine fibroblasts. In vivo biodistribution in CCl4 induced liver fibrotic mice, using near infrared (NIR) imaging of NP that were labeled with two different NIR-dyes (one coupled to the siRNA, one coupled to the NP shell) showed an equally efficient siRNA delivery to liver and liver resident myofibroblasts for both NP species. However, in vivo half-lives of NP and their siRNA cargo differed between the first and second generation of cationic nanohydrogel particles. After repetitive iv injection BioNP/siRNA-complexes exhibited, compared to their first generation, an enhanced biodegradability with less tendency to (over)-accumulate in fibrotic and healthy livers. Nevertheless, anti-procollagen α1(I) siRNA loaded bioNP induced a potent procollagen α1(I) mRNA knockdown and prevented fibrosis progression as determined by liver biochemical and morphometrical collagen quantification. Long-term monitoring of the carriers in the body revealed a significantly enhanced clearance for the acid-degradable carrier, especially after multiple dosing. In healthy mice, both species showed a broad therapeutic index in doses escalation studies up to 10mg siRNA/kg body weight. Therefore, the novel acid-degradable cationic bio-NP could be validated as a promising novel platform for siRNA delivery in vivo to treat fibrotic liver diseases. Since these NP also target other nonparenchymal cells, especially macrophages and endothelial cells, further studies to deliver siRNA to these cells are warranted.
Kationische Nanopartikel (NP) sind interessante Vehikel zur systemischen Applikation von siRNA. Wir testeten in vivo zum ersten Mal optimierte anti-procollagen α1(I) siRNA beladene NP zur antifibrotischen Therapie in CCl4 induzierten leberfibrotischen Mäusen. Nach gründlicher in vitro Untersuchung der anti-procollagen 1α(I) siRNA beladenen Partikel hinsichtlich ihrer Zytotoxizität, Zellaufnahme und ihrer Knockdown-Effizienz (in 3T3-Fibroblasten), konnten sie sich als vielversprechende siRNA Träger für in vivo Versuche qualifizieren. Nach intravenöser Applikation akkumulierten die siRNA beladenen Partikel beinahe ausschließlich in der Leber und nur marginal in Lunge, Milz und Niere. Auf zellulärer Ebene wurden die Komplexe primär von aktivierten Myofibroblasten und nur zu einem kleinen Teil von Endothelzellen, Makrophagen und Hepatozyten aufgenommen. Anti-procollagen α1(I) siRNA beladene NP reduzierten signifikant und sequenzspezifisch hepatisches prokollagen α1(I) mRNA Transkript, sowie die Gesamtmenge an Kollagen in leberfibrotischen Mäusen. Des Weiteren zeigte die Reduktion von α-SMA, ein Surrogatemarker für aktivierte Myofibroblasten, einen Erfolg der antifibrotischen Therapie. Somit qualifizierten sich NPs als geeignete siRNA Träger zur Adressierung nicht-parenchymale Zellen in der Leber. Da die erste Generation von NP/anti-procollagen α1(I) siRNA Komplexen bereits überzeugende Therapierfolge in fibrotischen Mäusen zeigte, versuchten wir ihre Bioabbaubarkeit und somit ihre Verträglichkeit zu verbessern. Eine verbesserte Abbaubarkeit der Partikel war wünschenswert, um bei längeren Anwendungen toxische Akkumulationen in Gewebe und Zellen zu verhindern. Für die zweite Generation von NP wurde ein säurelabiler Ketal-Linker, anstelle des vorherigen inerten Spermin-Linkers, zur Quervernetzung verwendet. Im Rahmen einer in vivo Vergleichsstudie wurde die erste Generation (nicht-bioNP) vs der zweiten Generation (bioNP), als Träger für anti-procollagen 1α(I) siRNA, verglichen. In vitro zeigten anti-procollagen 1α(I) siRNA beladene bioNP gegenüber nicht-bioNP keine Nachteile hinsichtlich Zytotoxizität (bis zu 400nM siRNA) und Zellaufnahme (~100% nach 24h). BioNP/anti-procollagen 1α(I)1 Komplexe wiesen bemerkenswerterweise einen effizienteren Knockdown für procollagen 1α(I) mRNA Transkript (bis zu 80% für bioNP) in 3T3 Fibroblasten auf. Beide Partikelspezies zeigten, nach intravenöser Injektion in (leber-)fibrotischen Mäusen, hinsichtlich ihrer in vivo Biodistribution (IVIS-imaging) für den carrier (NP) und ihr siRNA cargo (NP und siRNA mit verschiedenen nahinfraroten Fluorochromen markiert) eine vergleichbare effiziente Anreicherung in der Leber, als auch auf zellulärer Ebene in aktivierte Myofibroblasten (α-SMA+ Zellen). Die in vivo Halbwertszeit der säurelabilen bioNP/siRNA-Komplexe konnte, im Vergleich zu ihren Vorgängern, signifikant reduziert werden. Nach Akkumulation in der Leber wurden die bioNP/siRNA-Komplexe deutlich schneller abgebaut. Die verbesserte Abbaubarkeit der bioNP ging nicht auf Kosten ihrer therapeutischen Knockdown-Effizienz. Anti-procollagen 1α(I) siRNA beladene bioNP versus non-bioNP/ anti-procollagen 1α(I) siRNA Komplexe erzielten eine vergleichbare effiziente Reduktion des procollagen 1α(I) mRNA Transkripts als auch der Gesamtkollagenlast in fibrotischen Lebern. Im Rahmen eines Langzeit-in vivo-Monitorings (über 13 Tage) wiesen die säurelabilen siRNA Träger der zweiten Generation, nach wiederholter intravenöser Applikation, eine signifikant verbesserte Bioabbaubarkeit im Vergleich zu ihren Vorgängern auf. Beide siRNA beladene Partikelspezies wurden bei Dosis-Eskalationen bis zu 10mg/kg siRNA Körpergewicht von gesunden Mäusen sehr gut vertragen und lassen daher eine große therapeutische Breite vermuten. Die NP der zweiten Generation behielten alle positiven Eigenschaften ihrer Vorgänger bei und zeigten zusätzlich eine deutlich verbesserte in vivo Bioabbaubarkeit. Somit stellen bioNP, als eine vielversprechende Weiterentwicklung ihrer ersten Generation, eine neue Plattform für siRNA Träger dar. Da die NP, neben aktivierten Myofibroblasten, zusätzlich andere nicht-parenchymale Zellen insbesondere Makrophagen und Endothelzellen erreichen, können weitere therapeutische Ansätze mit ihnen als in vivo siRNA Träger ausgelotet werden.
DDC: 610 Medizin
610 Medical sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-4126
URN: urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000017949
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: XIII, 90 Blätter
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