Authors:	Moscariello, Pierpaolo
Title:	In vitro and in vivo investigation of dendronized streptavidin and fluorescent nanodiamonds, two flexible nanosystems efficiently crossing the blood-brain barrier to improve nanotheranostics in neurological disease treatment
Online publication date:	13-Sep-2019
Year of first publication:	2019
Language:	english
Abstract:	In treatment of central nervous system (CNS) diseases, the blood-brain barrier (BBB) is the main obstacle preventing drug molecule penetration from the bloodstream into the brain. In this thesis dendronized streptavidin (DSA) and fluorescent nanodiamonds (fNDs) encapsulated by a human serum albumin (HSA)-based biopolymer (dcHSA-fNDs) are presented as promising platforms for treatment of neurological disorders via crossing an intact BBB. DSA provides a flexible bio-click system composed of an adapter of tetrameric streptavidin linked to biotinylated PAMAM dendrimers, holding the potential to apply synergistically intrinsic therapeutic function of PAMAM dendrimers combined with any biotinylated drug activity on one platform. dcHSA-fNDs represent a very peculiar nanotheranostics tool characterized by the unique optical and magnetic properties of fNDs. Moreover, the HSA-based coating provides colloidal stability and improved functionalization capability. Thus, dcHSA-fNDs exhibit the potential of real time monitoring of drug delivery. In this thesis it is successfully demonstrated that both nanocompounds (1) are able to penetrate neurovascular unit (NVU) cells as shown by confocal imaging, immunocytochemical and biochemical analysis; (2) are transported from one side to the other of in vitro BBB models employing porcine and murine mono-cultures or murine triple co-cultures and, (3) the transport occurs via intracellular trafficking without induction of autophagy demonstrated by confocal analysis of colocalization with specific intracellular markers; (4) do not affect NVU cells viability and BBB integrity according to transendothelial electrical resistance monitoring, (5) are able to reach the brain and target NVU cells in vivo after intravenous injection as observable from screening of brain slices combined with immunohistochemistry. Specifically, DSA undergo lysosomal escape preserving cargo-carrier intracellular integrity and do not induce BBB disruption also in vivo validated by Evans Blue assay; dcHSA-fNDs show direct cell-cell migration in NVU cells moving along tunneling nanotubes; the mechanism occurs also among different cell types as observable combining live cell imaging and immunocytochemical analysis. For fNDs, this doctoral thesis provides for the first time reliable data on in vivo brain delivery and mechanisms of transport across the BBB. In summary, in this thesis two nanoplatforms targeting the brain using highly biocompatible non-invasive strategies to develop various therapeutic approaches are investigated in detail. In der Therapie von Erkrankungen des Zentralen Nervensystems (ZNS) stellt die Blut-Hirn-Schranke die größte Herausforderung dar, da sie die Passage von zahlreichen Wirkstoffen aus dem Blut ins Gehirn verhindert. Daher wurden in dieser Arbeit zwei vielversprechende Nanopartikel zur Überwindung der intakten Blut-Hirn-Schranke für die Therapie von neurologischen Krankheiten untersucht. Diese waren dendronisiertes Streptavidin (DSA) und fluoreszente Nanodiamanten (fND) beschichtet mit einem Biopolymer basierend auf Humanem Serum Albumin (dcHSA-fND). Die DSA Nanopartikel basieren auf einer flexiblen bio-click Chemie, die es ermöglicht das therapeutische Potential der PAMAM Dendrimere zu nutzen, wie auch biotinylierte Wirkstoffe an das System zu binden. Dazu sind an einen Streptavidin-Kern vier biotinylierte PAMAM (Poly(amidoamine)) Dendrimere gebunden. Die dcHSA-fND sind hervorragende nanotheranostische Partikel, da sie eine hohe Bioverträglichkeit, Stabilität und optische, wie auch magnetische Eigenschaften aufweisen. Darüber hinaus ermöglicht die Biopolymerbeschichtung eine kolloidale Stabilität und zahlreiche weitere Möglickeiten zur Funktionalisierung, um in Zukunft eine Echt-Zeit-Verfolgung des Wirkstofftransportes zu ermöglichen. In dieser Doktorarbeit konnte erfolgreich gezeigt werden, (1) dass beide Nanopartikel in Zelllen der neurovaskulären Einheit aufgenommen werden, belegt durch Konfokal-Mikroskopie, Immunzytochemie und biochemischen Analysen; (2) dass die Nanopartikel in einem in vitro Blut-Hirn-Schranken Modell (porcine und murine mono- oder Ko-Kulturen) von luminal nach abluminal transportiert wurden; (3) dass dies durch intrazellulären Transport ohne Induktion von Autophagosomen stattfindet, gezeigt duch Ko-Lokalisationsstudien mit verschiedenen Markern nach Konfokal-Mikroskopie. (4) Weiterhin konnte mittels Messung des transendothelialen Widerstandes gezeigt werden, dass weder die Vitalität noch die Integrität der Blut-Hirn-Schranke, beeinträchtigt wird. (5) Die untersuchten Nanopartikel waren nach intravenöser Injektion im Gehirnparenchym und den Zellen der neurovaskulären Einheit mittels Immunhistologie und Konfokal-Mikroskopie in vivo nachzuweisen. Weiterhin konnte für DSA gezeigt werden, dass diese einer lysosomalen Degradation entgehen. Das dcHSA-fND in vivo die intakte Blut-Hirn-Schranke überwinden, konnte nach Ko-Applikation von DSA und Evans Blue gezeigt werden. Mittels Lebendzell-Mikroskopie und Immunzytochemie konnte außerdem ein direkter Zell-Zell-Transport in Zellen der Neurovaskulären Einheit entlang von tunneling nanotubes gezeigt werden. Somit wurde in dieser Arbeit zum ersten mal ein Transport von fluoreszenten Nanodiamanten über die intakte Blut-Hirn-Schranke ins Gehirn gezeigt. Zusammenfassend, wurden in dieser Arbeit erfolgreich zwei verschiedenartige bioverträgliche Nanopartikel als Basis für verschiedene Therapien im Detail untersucht, welche das Gehirn mittels nicht-invasiven Strategien erreichen.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin Externe Einrichtungen
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3755
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000030865
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	102 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen