Authors:	Makhoul, Stephanie
Title:	GPIb-V-IX- and GPVI-specific intracellular signaling and their regulation by PKA/PKG-dependent inhibitory pathways in washed human platelets
Online publication date:	27-Aug-2019
Year of first publication:	2019
Language:	english
Abstract:	The von Willebrand factor and collagen are the main physiological ligands of two platelet receptors, GPIb-IX-V and GPVI, respectively, which play an essential role in platelet adhesion and thrombus formation. However, these agonists also bind to the integrins αIIbβ3 and α2β1, respectively, which prevents the analysis of specific GPIbα and GPVI signaling. C type lectin snake toxins are widely used as specific platelet receptor ligands. Echicetin is a selective GPIbα agonist when coated on polystyrene beads (EB), whereas convulxin (cvx) induces GPVI-specific signaling. Despite having this important role, intracellular GPIbα and GPVI signaling and their regulation by other pathways are not well defined. This limitation was addressed here using EB and cvx, in order to study the effects of GPIbα and GPVI activation on platelet aggregation, Syk tyrosine kinase, Syk substrates and the crosstalk with inhibitory pathways. Echicetin purified from snake Echis carinatus sochureki venom was validated by mass spectrometry. Washed human platelets were stimulated with EB or cvx, in the presence or absence of echicetin monomers (EM), Src family kinase (SFK) inhibitors, Syk inhibitors and the cAMP-, cGMP-elevating agents, iloprost and riociguat respectively. Platelet aggregation was analyzed by light transmission aggregometry, protein phosphorylation by immunoblotting. Intracellular messengers inositol monophosphate (IP1) and Ca2+i were measured by ELISA and Fluo-3 AM/FACS, respectively. GPIbα and GPVI-specific agonists, EB and convulxin, induced full platelet aggregation and strong phosphorylation of tyrosine and serine/threonine protein kinases and substrates such as Syk, PLCγ2 (a direct Syk substrate) and Akt (a Syk downstream effector). These activation mechanisms were SFK- and Syk-dependent, integrin αIIbβ3 independent and differentially required the secondary mediators ADP, TxA2. The activation of cAMP or cGMP pathways by iloprost or riociguat, respectively, strongly inhibited platelet aggregation and Akt phosphorylation but not EB/cvx-induced tyrosine phosphorylation of Syk and PLCγ2, which was often enhanced. For the first time in platelets, an important human model system for Syk regulation, a strong, stoichiometric but transient stimulation of Syk S297 phosphorylation by EB/GPIbα and cvx/GPVI was observed, which was abolished by PKC inhibition and by the PKA/PKG system. Both interventions caused Syk tyrosine hyperphosphorylation and increased activation. The Syk S297 phosphorylation site is located within the interdomain B, which is a hot spot for Syk regulation by multiple modifications. The major inhibitory pathways PKA/PKG strongly inhibited EB/cvx-induced platelet aggregation and Akt phosphorylation but, in contrast, enhanced Syk and LAT/PLCγ2 tyrosine phosphorylation (hyperphosphorylation). These data suggest that Syk and Syk effector systems are differentially regulated by protein kinases PKA, PKG, and PKC. This is also supported by the data that EB/cvx-induced Ca2+-release was Syk-dependent, but only partially inhibited by PKA/PKG pathways. Overall, the results of this project demonstrate EB and EM as specific agonists and antagonists, respectively, of GPIbα-mediated Syk activation modulating platelet aggregation. This is independent of the integrin alphaIIbbeta3 and GPVI activation. The cAMP/PKA and cGMP/PKG pathways do not inhibit but enhance GPIbα-/GPVI-initiated, SFK dependent Syk activation, but strongly inhibit further downstream responses including aggregation. GPIbα and GPVI affect distinct signaling pathways, which are similar but not identical. These data establish an important intracellular regulatory network induced by GPIbα and GPVI with Syk as central element. This essential kinase is controlled by multiple phosphorylation sites, modifications and binding proteins and has multiple substrates as effector system, which are not fully understood yet. Der Von Willebrand-Faktor und Kollagen repräsentieren die physiologischen Hauptliganden von zwei wichtigen Thrombozytenrezeptoren, GPIb-IX-V und GPVI, die eine wesentliche Rolle bei der Thrombozytenadhäsion und Thrombusbildung spielen. Jedoch binden diese Agonisten auch an die Integrine αIIbβ3 bzw. α2β1, was die Analyse spezifischer GPIbα- und GPVI-Signale verhindert. C-Typ-Lektin Schlangentoxine werden häufig als spezifische Thrombozytenrezeptorliganden verwendet. Echicetin, immobilisiert auf Polystyrol- Beads (EB), ist ein selektiver GPIbα-Agonist, während Convulxin (Cvx) GPVI-spezifische Signale induziert. Trotz dieser wichtigen Rolle sind die intrazellulären GPIbα- und GPVI-Signale und ihre Regulation durch andere Signalwege nicht genau definiert. Diese Einschränkung wurde hier mit EB und Cvx behoben, um die Auswirkungen der GPIbα- und GPVI-Aktivierung auf die Thrombozytenaggregation, die Syk-Tyrosinkinase, die Syk-Substrate und das Ansprechen auf inhibitorischen Signalwegen zu untersuchen. Aus Schlangen gereinigtes Echicetin-Gift von Echis carinatus sochureki wurde durch Massenspektrometrie validiert. Gewaschene humane Thrombozyten wurden mit EB oder Cvx in An- oder Abwesenheit von Echicetin-Monomeren (EM), Inhibitoren der Src-Familienkinase (SFK), Syk-Inhibitoren und den cAMP-, cGMP-erhöhenden Mediatoren, Iloprost bzw. Riociguat, stimuliert. Anschließend wurden die Thrombozytenaggregation durch Lichttransmissionsaggregometrie und die Proteinphosphorylierung durch Immunblotting analysiert. Die intrazelluläre Botenstoffe Inositmonophosphat (IP1) bzw. Ca2+i wurden mittels ELISA bzw. Fluo-3 AM/FACS gemessen. Die GPIbα- und GPVI-spezifische Agonisten, EB und Convulxin, induzierten eine vollständige Thrombozytenaggregation und eine starke Phosphorylierung von Tyrosin- und Serin/Threonin-Proteinkinasen und Substraten wie Syk, PLCγ2 (eines der direkten Syk-Substrate) und Akt (eines der Syk-Downstream-Effektoren). Diese Aktivierungsmechanismen waren SFK- und Syk-abhängig, Integrin αIIbβ3-unabhängig und erforderten die sekundären Mediatoren ADP und TxA2. Die Stimulierung von cAMP- oder cGMP-Signalwegen durch Iloprost oder Riociguat inhibierte deutlich die Thrombozytenaggregation und die Akt-Phosphorylierung, jedoch nicht die EB/Cvx-induzierte Tyrosinphosphorylierung von Syk und PLCγ2, die häufig verstärkt wurde. Zum ersten Mal wurde in Thrombozyten ein wichtiges menschliches Modellsystem für die Syk-Regulation, eine starke, stöchiometrische, aber transiente Stimulierung der Syk S297-Phosphorylierung durch EB/GPIbα und Cvx/GPVI, beobachtet, die durch PKC-Hemmung und durch PKA/PKG aufgehoben wurde. Im Gegensatz dazu, verursachten beide Interventionen eine Syk-Tyrosin-Hyperphosphorylierung und eine vermehrte Aktivierung. Die Syk S297-Phosphorylierungsstelle befindet sich innerhalb der Interdomäne B, die durch mehrere Modifikationen ein Zentrum für die Syk-Regulation darstellt. Die inhibitorischen Signalwege, die durch PKA/PKG kontrolliert werden, hemmen die EB/Cvx-induzierte Thrombozytenaggregation und die Akt-Phosphorylierung, im Gegensatz dazu verstärkten sie die Syk- und LAT/PLCγ2-Tyrosinphosphorylierung (Hyperphosphorylierung). Diese Daten zeigen, dass Syk- und Syk-Effektorsysteme durch Proteinkinasen PKA, PKG und PKC unterschiedlich reguliert werden. Dies wird gestützt durch die EB/Cvx-induzierte Ca2+-Freisetzung, die Syk-abhängig war, jedoch nur teilweise durch PKA/PKG-Signalwege inhibiert wurde. Insgesamt zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass EB und EM spezifische Agonisten bzw. Antagonisten der GPIbα-vermittelten Syk-Aktivierung sind, die die Thrombozytenaggregation modulieren. Dies ist unabhängig von der Aktivierung des Integrins alphaIIbb3 und GPVI. Die cAMP/PKA- und cGMP/PKG-Signalwege hemmen nicht die GPIbα-/GPVI-initiierte, SFK-abhängige Syk-Aktivierung jedoch weitere Downstream-Reaktionen, einschließlich der Aggregation. GPIbα und GPVI beeinflussen unterschiedliche Signalwege, die ähnlich, aber nicht identisch sind. Diese Daten bilden die Grundlage für ein wichtiges intrazelluläres regulatorisches Netzwerk, das durch GPIbα und GPVI mit Syk als zentralem Element induziert wird. Diese essentielle Kinase wird durch mehrere Phosphorylierungsstellen, Modifikationen und Bindungsproteinen gesteuert und weist mehrere Substrate als Effektorsystem auf, die noch nicht vollständig verstanden sind.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3745
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000030714
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	132 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen