Authors:	Linke, Matthias
Title:	Der Einfluss assistierter Reproduktionstechniken auf die epigenetische Reprogrammierung in der fruehen Embryogenese und Gametogenese im Mausmodell
Online publication date:	7-Jan-2014
Year of first publication:	2014
Language:	german
Abstract:	Seit der Geburt von Louise J. Brown (1978) als erstem künstlich erzeugtem Kind hat sich die Nachfrage nach assistierten Reproduktionstechniken (ART) stark erhöht. Der Anteil der nach In-vitro-Fertilisation (IVF) oder Intrazytoplasmatischer Spermieninjektion (ICSI) geborenen Kinder macht mittlerweile abhängig vom betrachteten Industrieland zwischen 1-4% an der Gesamtgeburtenzahl aus. In zahlreichen Studien korreliert eine erhöhte Prävalenz für seltene Imprinting-Erkrankungen, wie z.B. Beckwith-Wiedemann oder Angelman-Syndrom, mit der Geburt nach assistierten Reproduktionstechniken. Es ist bekannt, dass die medizinischen Interventionen zur Behandlung von Sub- und Infertilität in sehr sensitive Phasen der epigenetischen Reprogrammierung des Embryos und der Keimzellen eingreifen. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob die ovarielle Stimulation einen Einfluss auf die epigenetische Integrität von geprägten Genen in murinen Präimplantationsembryonen hat. Die in diesem Zusammenhang entwickelte digitale Bisulfitpyrosequenzierung gewährleistet die Analyse der DNA-Methylierung auf Einzelallelebene durch eine adäquate Verdünnung der Probe im Vorfeld der PCR. Die ovarielle Induktion führte zu einem erhöhten Rate an Epimutationen des paternalen H19-Allels, sowie des maternalen Snrpn-Allels. Zudem konnte festgestellt werden, dass die Expression von drei potentiellen Reprogrammierungsgenen (Apex1, Polb, Mbd3) in Embryonen aus hormonell stimulierten Muttertieren dereguliert ist. Whole-Mount Immunfluoreszenzfärbungen für APEX1 korrelierten dessen differentielle Genexpression mit dem Proteinlevel. Anzeichen früher apoptotischer Vorgänge äußerten sich in Embryonen aus hormonell induzierten Muttertieren in der hohen Rate an Embryonen, die keines der drei Transkripte exprimierten oder weniger APEX1-positive Blastomeren aufwiesen.In einer weiteren Fragestellung wurde untersucht, ob die Kryokonservierung muriner Spermatozoen den epigenetischen Status geprägter Gene in den Keimzellen beeinflusst. Die Analyse von F1-Zweizellembryonen, die durch IVF mit den jeweiligen Spermatozoen eines Männchens generiert wurden, diente der Aufklärung möglicher paternaler Transmissionen. Insgesamt konnten keine signifikanten Auswirkungen der Kryokonservierung auf den epigenetischen Status in Spermatozoen und F1-Embryonen ermittelt werden. Since the birth of Louise Brown, the first in-vitro child, the demand for assisted reproductive technologies (ART) has greatly increased. Children born after in-vitro fertilization (IVF) or intracytoplasmic sperm injection (ICSI) now accounts for 1-4 % of the total number of births depending on the considered industrialized country. Numerous studies have correlated an increased prevalence of rare imprinting disorders such as Beckwith-Wiedemann or Angelman syndrome with the birth after assisted reproduction techniques. It is known that the medical interventions for the treatment of sub- and infertility interfere with very sensitive phases of epigenetic reprogramming of the embryo and the germ cells. In the thesis presented, it was examined whether ovarian stimulation has an influence on the epigenetic integrity of imprinted genes in mouse preimplantation embryos. We developed â Digital Bisulfite-Pyrosequencingâ to ensure the analysis of DNA methylation on single allele resolution by adequate dilution of the sample prior to PCR. Ovarian induction resulted in an increased rate of epimutations of the paternal H19 allele and the maternal Snrpn allele. Furthermore it was found that the expression of three potential reprogramming genes (Apex1, Polb, Mbd3) was deregulated in embryos from hormonally stimulated females. Performing Whole-mount immunofluorescence staining for APEX1 in different developmental stages of the murine preimplantation embryo, we could correlate its differential expression with the protein level. Signs of early apoptotic events were detected in embryos from hormonally induced females and were expressed in the high rate of embryos that expressed none of the three transcripts or less APEX1-positive blastomeres. In a further question was examined whether cryopreservation of murine spermatocytes influences the epigenetic status of imprinted genes in the germ cells. The analysis of F1 two-cell embryos generated through IVF with the respective spermatocytes of the same male served up the clarification of paternal transmissions. Overall, no significant effect of cryopreservation on the epigenetic status in spermatocytes and F1 embryos could be determined.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3655
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-36120
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	164 Bl.
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