Authors:	Ernst, Anna Luise
Title:	Regulation of the TET1 protein in active DNA demethylation
Online publication date:	9-Dec-2019
Year of first publication:	2019
Language:	english
Abstract:	Active DNA demethylation plays an important role in various biological contexts, such as embryonic development and embryonic stem cell (ESC) differentiation. The Ten-Eleven Translocation (TET) family enzymes play a key role in this process, as they iteratively oxidize 5-methylcytosine (5mC) to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC). 5fC and 5caC can subsequently be removed by Thymine DNA glycosylase (TDG) and unmethylated cytosine is restored by base excision repair (BER), completing the process of active DNA demethylation. Before the discovery of the role of TET enzymes in active DNA demethylation, the Growth arrest and DNA-damage-inducible protein 45 alpha (GADD45A) had already been implicated in active DNA demethylation, but its exact role remained unknown. Recent findings highlighted that GADD45A physically and functionally cooperates with the TET family member TET1 to mediate active DNA demethylation. However, the mechanism by which GADD45A enhances TET1 activity is yet poorly understood. In addition, how TET enzymes are targeted to genomic loci, especially to enhancers, remains largely unresolved. In fact, whereas TET binding sites are mostly found at promoters, the oxidation products of TET – 5hmC, 5fC and 5caC – are mostly enriched at enhancers. In this thesis, I explored two TET-related topics 1) TET1 regulation by GADD45A and 2) TET regulation by RAD21-dependent chromatin looping. First, I found that the GADD45A interactor Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 4 (MAP3K4) is most likely not involved in enhancing TET1 activity in a GADD45A-dependent manner. Then, I demonstrated that GADD45A can affect TET1 post-translational modifications: GADD45A decreases the ubiquitination and SUMOylation of full-length TET1, while it enhances the SUMOylation of the catalytic domain of TET1 (TET1CD). Finally, I established that GADD45A stabilizes TET1 protein levels, putatively by preventing Calpain-mediated decay. Nevertheless, the detailed mechanism behind this stabilization remains to be resolved in the future. A proposed model by which TET enzymes are targeted to enhancers to oxidize 5mC is promoter-enhancer looping. Promoter-enhancer loops are established by the Cohesin complex and can be abolished by depleting one of its subunits, such as RAD21. To test this model, I investigated the distribution of 5fC in RAD21-depleted – and hence promoter-enhancer loop depleted – mouse ESCs (mESCs) and observed that the deposition of 5fC at enhancers is RAD21-loop independent. Although these results do not provide an ultimate explanation for the discrepancy between TET binding sites at promoters and the enrichment of 5hmC, 5fC and 5caC at enhancers, this analysis supports the conclusion that targeting of enhancer demethylation does not rely on RAD21-dependent chromatin loops. Aktive DNA-Demethylierung spielt eine wichtige Rolle in verschiedenen biologischen Zusammenhängen, wie beispielsweise der Embryonalentwicklung oder der embryonalen Stammzelldifferenzierung. Die Enzyme der Ten-Eleven Translocation (TET) Familie nehmen hierbei eine Schlüsselposition ein, indem sie 5-Methylcytosin (5mC) iterativ zu 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC), 5-Formylcytosin (5fC), sowie 5-Carboxylcytosin (5caC) oxidieren. 5fC und 5caC können daraufhin von der Thymine DNA glycosylase (TDG) entfernt werden, und unmethyliertes Cytosin durch Enzyme der Basenexzisionsreparatur (BER) wiederhergestellt werden, welches den Prozess der aktiven DNA-Demethylierung vervollständigt. Bereits vor der Entdeckung der Rolle der TET Enzyme in der aktiven DNA-Demethylierung wurde das Protein Growth arrest and DNA-damage-inducible protein 45 alpha (GADD45A) mit der aktiven DNA-Demethylierung in Verbindung gebracht, jedoch blieb dessen Wirkmechanismus unklar. Neueste Erkenntnisse zeigen, dass GADD45A physisch und funktionell mit TET1 in der aktiven DNA-Demethylierung kooperiert, allerdings ist über die mechanistischen Details dieser Kooperation weiterhin wenig bekannt. Zudem bleibt ungelöst, wie TET Enzyme gezielt zu genomischen Loci rekrutiert werden. Tatsächlich befinden sich TET-Bindungsstellen überwiegend an Promotoren, während die TET-Oxidationsprodukte – 5hmC, 5fC, sowie 5caC – größtenteils an Enhancern angereichert sind. In der vorliegenden Arbeit untersuchte ich zwei TET-relevante Themen: 1) TET1 Regulation durch GADD45A und 2) TET Regulation durch RAD21-abhängiges Chromatin Looping. Erstens stellte sich heraus, dass die mit GADD45A interagierende Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 4 (MAP3K4) höchstwahrscheinlich nicht an dem TET1-aktivierenden Prozess durch GADD45A involviert ist. Außerdem demonstrierte ich, dass GADD45A posttranslationale Modifikationen von TET1 beeinflusst: GADD45A verringert die Ubiquitinierung sowie die SUMOylierung des Gesamtlängen-TET1-Proteins, während es die SUMOylierung der katalytischen TET1-Domäne verstärkt. Ferner stabilisiert GADD45A die TET1-Proteinspiegel, vermutlich durch die Verhinderung eines Calpain-vermittelten Proteinabbaus. Dennoch bleibt der vollständige Mechanismus dieser Stabilisation noch zu klären. Ein vorgeschlagenes Modell, welches darlegt wie TET-Enzyme gezielt zu Enhancern zum Zwecke der 5mC Oxidierung rekrutiert werden, ist Promoter-Enhancer-Looping. Promoter-Enhancer Loops werden mittels des Cohesin Komplexes generiert und können durch Depletion von Untereinheiten, beispielsweise RAD21, aufgelöst werden. Um dieses Modell zu testen, erforschte ich die Verteilung von 5fC in RAD21 depletierten, und demzufolge Promoter-Enhancer-Loop depletierten Mausstammzellen und zeige, dass das Vorkommen von 5fC an Enhancern RAD21-Loop unabhängig ist. Wenngleich diese Ergebnisse keine endgültige Erläuterung der Diskrepanz zwischen TET-Bindungsstellen an Promotoren und der Anreicherung von 5hmC, 5fC, sowie 5caC an Enhancern liefern, so legen meine Ergebnisse nahe, dass DNA-Demethylierung, zumindest im Kontext RAD21-abhängiger Loops, unabhängig der dreidimensionalen Chromatinstruktur erfolgen kann.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	Externe Einrichtungen
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3577
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000032049
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	117 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen