Authors:	Bai, Lin
Title:	Genetische und funktionelle Analyse von Vesikelmembranprotein-Mutanten in Maus und Caenorhabditis elegans
Online publication date:	31-Mar-2008
Year of first publication:	2008
Language:	german
Abstract:	Tetraspan vesicle membrane proteins (TVPs) sind konservierte, ubiquitär vorkommende Membranproteine synaptischer Vesikel und zytoplasmatischer Transportvesikel. Bei Säugetieren lassen sie sich in die Physine, Gyrine und SCAMPs (secretory carrier-associated membrane proteins) unterteilen, die im Nematoden C. elegans jeweils nur durch ein einzelnes Polypeptid vertreten sind (Synaptophysin-1 [SPH-1], Synaptogyrin- 1 [SNG-1] und SCAMP-1 [SCM-1]). Obwohl den TVPs eine Beteiligung bei der Regulation des Vesikelzyklus zugesprochen wurde, sind Synaptophysin-1-Knockout-Mäuse und vollständig TVP-defiziente Würmer gesund und weisen nur geringgradige Veränderungen auf. In dieser Arbeit sollten daher zum einen genomweite komparative Transkriptomanalysen durchgeführt werden, um mögliche Kompensationsmechanismen in der Maus und C. elegans zu finden, zum anderen sollten mit Hilfe pharmakologischer Stressassays und genetischer Verfahren Schwachstellen und Redundanzen identifiziert werden. Erstaunlicherweise konnten durch Affymetrix GeneChip-Analysen der RNA in der Retina von Synaptophysin-1-/--Mäusen keine differenziell exprimierten Gene gefunden werden. Bei der Untersuchung der C. elegans-TVP-Dreifachmutante wurden hingegen 17 Gene mit erhöhter und 3 mit erniedrigter Transkription identifiziert. Die Befunde für 12 hochregulierte Gene wurden durch quantitative Real-Time RT-PCR bestätigt. Das am stärksten hochregulierte Gen arf- 1.1 kodiert für eine GTPase, die vermutlich an der Regulation der Vesikelbildung beteiligt ist. Von den ebenso identifizierten Genen cdr-2, cdr-4 und pgp-9 ist bekannt, dass sie in Stresssituationen, z. B. in Gegenwart von Cadmium, verstärkt transkribiert werden. ugt-62 und ugt-19 kodieren für Glucuronosyltransferasen. Für arf-1.1, cdr-2, ugt-62 sowie für das Gen T16G1.6, das für eine coiled-coil-Domäne kodiert, wurden im Folgenden fluoreszierende Promoterkonstrukte hergestellt, um Koexpressionsmuster mit TVPs zu bestimmen. Es stellte sich heraus, dass alle vier Promoterkonstrukte im Darm zusammen mit SPH-1 und SCM-1 im Darm transkribiert werden. Mit fluoreszierenden Translationschimären konnte weiterhin gezeigt werden, dass ARF-1.1 und CDR-2 mit den Darm-spezifischen TVPs im apikalen Bereich der Darmzellen kolokalisieren. Um mehr über die Funktion von TVPs im Vesikelzyklus zu erfahren, wurden pharmakologische und genetische Analysen von Würmern durchgeführt, in denen die Expression des Neuronen- spezifischen SNG-1 verändert ist. Deletion oder Überexpression führte zu einer Resistenz gegenüber dem Acetylcholinesterase-Inhibitor Aldicarb und zu erhöhter Empfindlichkeit gegenüber dem GABA-Rezeptor-Antagonisten Pentylentetrazol. Auf genetischer Ebene zeigte sich, dass sng-1 synthetisch mit den Genen für Synaptotagmin-1, Endophilin A sowie Synaptojanin wirkt. Die beobachteten Effekte weisen auf alternative Funktionen in der synaptischen Übertragung hin und unterstützen zugleich die Hypothese, dass SNG-1 im synaptischen Vesikelzyklus eine wichtige Funktion erfüllt, die möglicherweise einem noch unbekannten redundanten Kompartiment-spezifischen Signalweg der synaptischen Transmission zuzuordnen ist. Tetraspan vesicle membrane proteins (TVPs) are conserved, ubiquitously expressed membrane proteins of synaptic vesicles and cytoplasmic transport vesicles. They are grouped in three distinct gene families, the physins, gyrins, and SCAMPs (secretory carrier associated membrane proteins). Several members of each family are found in mammals whereas only a single member of each family is present in C. elegans (synaptophysin-1 [SPH-1], synaptogyrin-1 [SNG-1] and SCAMP-1 [SCM-1]). Although TVPs are involved in the regulation of vesicle trafficking, synaptophysin-1 knockout mice and completely TVP-deficient worms are still healthy and exhibit only minor alterations. To find out if compensatory mechanisms at the transcriptional level account for the apparent lack of functional deficiencies in mouse and C. elegans, genome-wide comparative transcriptome analyses were carried out. Furthermore, with the aid of pharmacological stress assays and genetic screens weak points and redundancies were identified. Using high-density microarray Affymetrix GeneChips, no significant changes of gene expression were detected in the retina of synaptophysin-1-deficient mice. In contrast, transcriptome analyses of the C. elegans TVP triple mutants identified 17 up-regulated and 3 down-regulated genes. The up-regulation of twelve genes was confirmed by quantitative real-time RT-PCR. The most strongly up-regulated gene arf-1.1 codes for a small GTPase, which is probably involved in the regulation of vesicle formation. The three other genes cdr-2, cdr-4 and pgp-9 are all known to be rapidly transcribed in stress situations, most notably in the presence of cadmium. ugt-62 and ugt-19 encode for glucuronosyl transferases. In order to determine co-expression patterns promoter-driven fluorescent constructs were prepared for arf-1.1, cdr-2, ugt-62, and for T16G1.6 which encodes a coiled-coil domain-containing polypeptide. All four promoter constructs were found to be co-transcribed with sph-1 and scm-1 in the intestine. In addition, it could be shown that fluorescent translational chimeras for ARF-1. 1 and CDR-2 co-localize with the intestine-specific TVPs in the apical part of intestinal cells. To further examine the function of TVPs in the vesicle cycle, pharmacological and genetic analyses were performed in worms, in which the expression of the neuron-specific TVP SNG-1 was modified. Deletion or overexpression of SNG-1 caused increased resistance to the acetylcholinesterase inhibitor aldicarb and increased sensitivity to the GABA receptor antagonist pentylenetetrazol. At the genetic level it was shown that sng-1 acts synthetically with the genes for synaptotagmin-1, endophilin A and synaptojanin. The observed effects suggest that SNG-1 fulfils an important function in the synaptic vesicle cycle. This function is probably due to a still unknown redundant and compartment-specific signalling pathway of synaptic neurotransmission.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2548
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-16056
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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