Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-2083
Authors: Usanova, Svetlana
Title: Untersuchungen zur Chemosensitivität von testikulären Tumorzellen gegenüber Cisplatin
Online publication date: 27-Jul-2012
Year of first publication: 2012
Language: german
Abstract: Metastasierender Krebs ist bei Erwachsenen in der Regel nicht heilbar. Eine Ausnahme stellen testikuläre Keimzelltumoren (TKZT) dar, da über 75 % der Patienten mit fortgeschrittenen metastasierenden TKZT mit einer auf Cisplatin basierenden Kombinations-Chemotherapie geheilt werden können. Zelllinien, die aus TKZT isoliert wurden, behalten diese Cisplatin- Sensitivität in vitro bei. Somit spiegeln Testistumorzelllinien die klinische Situation wider und sind deswegen ein gutes Modellsystem um zu untersuchen, welche Faktoren der Cisplatin-Sensitivität zugrunde liegen. Die Ursachen der Cisplatin-Sensitivität in Testistumoren sind nicht bekannt. Es wurde bereits gezeigt, dass Testistumorzellen eine geringe Kapazität für die Entfernung von Cisplatin-induzierten DNA-Platinierungen aufweisen. Dieser Defekt in der DNA-Reparatur könnte ein Faktor für die beobachtete Cisplatin-Sensitivität sein. Cisplatin induziert sowohl Intrastrang-Vernetzungen als auch Interstrang-Vernetzungen (ICLs). Die Bildung und Reparatur der Cisplatin-induzierten Intrastrang-Vernetzungen wurde mittels DNA-Slot-Blot, die Bildung und Entfernung von Interstrang-Vernetzungen wurde mithilfe des Comet-Assays untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die Reparatur von Intrastrang-Vernetzungen in Testis- und Blasentumorzelllinien vergleichbar ist. Somit sind Testistumorzellen in diesem Reparaturweg nicht beeinträchtigt. Im Unterschied dazu zeigte sich, dass Testistumorzellen die ICLs nicht oder nur mit einer reduzierten Kapazität entfernen können.Da die ICL-Reparatur über die Bildung von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB) mit anschließender DSB-Reparatur verläuft, wurde die Kinetik der DSB-Reparatur anhand der Immundetektion der Histon-Variante γH2AX, die zur Visualisierung von DSB verwendet wird, verfolgt. γH2AX Foci wurden nach Behandlung mit Cisplatin in Testistumorzellen und Blasentumorzellen gebildet. Anders als in Blasentumorzellen blieb der Prozentsatz an γH2AX-positiven Zellen in Testistumorzellen bestehen. Offensichtlich konnten die Testistumorzellen die Cisplatin-induzierten ICLs nicht korrekt prozessieren, was dazu führte, dass γH2AX Foci persistierten. Da unreparierte DNA-Läsionen eine DNA-schadensabhängige Antwort einleiten können, wurde die Aktivierung der Hauptfaktoren dieser Signalwege untersucht. In den Testistumorzellen zeigte sich eine Erhöhung der p53 Proteinmenge nach Cisplatin-Behandlung. Des Weiteren wurde die durch Cisplatin induzierte Aktivierung von ATM/ATR, Chk1/Chk2, Bax und Noxa in Testis- und Blasentumorzellen vergleichend untersucht. Es wurde bereits gezeigt, dass der Reparaturfaktor ERCC1-XPF in Testistumorzelllinien reduziert vorliegt. Um eine mögliche Rolle von ERCC1-XPF für die Reparatur-Defizienz der ICLs und Cisplatin-Sensitivität in Testistumorzellen zu analysieren, wurde ERCC1-XPF in der Testistumorenzelllinie 833K mithilfe eines Expressionsvektors überexprimiert, und der Einfluss von ERCC1-XPF auf ICL-Reparatur sowie Cisplatin-Sensitivität wurde ermittelt. Überexpression von ERCC1-XPF führte zur Reparatur der ICLs in 833K-Zellen und verminderte die Cisplatinsensitivität. Somit scheint die Cisplatinsensitivität der Testistumorzellen, zumindest zum Teil, auf einer verminderten ICL-Reparatur zu beruhen. Des Weiteren wurde in „proof of principle“ Experimenten ERCC1-XPF in der Cisplatin-resistenten Blasentumorzelllinie MGH-U1 mittels siRNA herunterreguliert, und die Auswirkung der Herunterregulation auf die ICL-Reparatur und die Cisplatinsensitivität wurde geprüft. RNA-Interferenz-vermittelte Herunterregulierung von ERCC1-XPF reduzierte die Prozessierung der Cisplatin-induzierten ICLs und verstärkte die Cisplatinsensitivität in MGH-U1 Zellen. Somit wurde in dieser Arbeit zum ersten Mal gezeigt, dass die Testistumorzellen in Vergleich zu Blasentumorzellen in der Reparatur von ICLs defizient sind, wobei die verminderte ICL-Reparatur auf die geringe Expression von ERCC1-XPF zurückgeführt werden konnte. Diese ICL-Reparatur-Defizienz könnte, zumindest zu einem Teil, für die Sensitivität der Testistumoren gegenüber Cisplatin verantwortlich sein.
Metastatic testicular germ cell tumors are cured in over 75 % of patients using cisplatin-based combination therapy. In contrast, almost all other solid cancers in adults are incurable once they have spread beyond the primary site. Cell lines derived from testicular germ cell tumors retain this cisplatin hypersensitivity in vitro, therefore providing a good model system for investigating the factors controlling cisplatin sensitivity. The reasons underlying the cisplatin sensitivity are not yet known. Earlier findings showed that testis tumor cells have a reduced capacity to repair cisplatin induced DNA damage suggesting that repair deficiency might be a factor for the observed cisplatin sensitivity. Cisplatin induces both intrastrand adducts (IAs) and interstrand crosslinks (ICLs). To investigate repair of IAs we used the method of DNA slot blotting, repair of ICLs was investigated using the Comet assay. We found that testis tumor cells have a similar repair rate of IAs compared to cisplatin resistant bladder cancer cells. In contrast, the repair of ICLs was significantly reduced in testis tumor cells compared to bladder cancer cells. It is proposed that ICL repair proceeds via the formation of a double strand break. To visualize DSBs we used immunodetection of histone variant γH2AX. We found that γH2AX foci formed in both bladder and testis tumor cells after cisplatin treatment. However the γH2AX foci persisted in the testis tumor cells indicating a reduction in removal of the DSBs in the testis tumor cells compared to bladder cancer cells. Persisting DNA damage might result in activation of downstream processing pathways of the lesions. We found that treatment of testis tumor cells with cisplatin lead to activation of p53 in a time dependent manner. Phosphorylation of ATM/ATR, Chk1/2 and induction of apoptotic factors controlled by p53 was investigated in testis versus bladder cancer cells. Earlier studies showed that the nucleotide excision repair factor ERCC1-XPF is reduced in testis tumor cell lines indicating a possible role of ERCC1- XPF for repair deficiency and cisplatin sensitivity of testis tumor cells. To investigate the role of ERCC1-XPF, we overexpressed ERCC1-XPF in testis tumor cells using a mammalian expression vector. Overexpression of ERCC1-XPF increased ICL repair and rendered the cells more resistant to cisplatin suggesting that ERCC1-XPF is rate-limiting for repair of ICLs and subsequent cisplatin sensitivity of testis tumor cells. In proof of principle experiments we down regulated ERCC1-XPF in the cisplatin resistant bladder cancer cell line MGH-U1. ERCC1 siRNA reduced the level of ERCC1 and led to a significant increase in cisplatin sensitivity in MGH-U1 cells.Our data indicate for the first time that the exceptional sensitivity of testis tumor cells and, therefore, very likely the curability of testicular germ cell tumors rests at least in part on their limited ICL repair due to low level of expression of ERCC1-XPF.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-2083
URN: urn:nbn:de:hebis:77-31887
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 155 S.
Appears in collections:JGU-Publikationen

Files in This Item:
  File Description SizeFormat
Thumbnail
3188.pdf2.17 MBAdobe PDFView/Open