Authors:	Scheller, Yvonne
Title:	Detektion von Nickel- und Cobaltspezies in einzelnen lebenden Zellen mit hoher lateraler Auflösung
Online publication date:	4-Nov-2013
Year of first publication:	2013
Language:	german
Abstract:	Übergangsmetallen wie Nickel und Cobalt kommt meist eine große Bedeutung als Cofaktor in Enzymen oder Metallkomplexen im Metabolismus von Lebewesen zu. Da eine sehr geringe Konzentration dieser Übergangsmetalle in einer Zelle für deren Funktionalität ausreicht, ist eine konstante Konzentration der Spurenelemente in einer Zelle angestrebt. Durch meist anthropogene Einflüsse sind Pflanzen und Menschen zunehmend hohen Konzentrationen von Übergangsmetallen ausgesetzt, die in Abhängigkeit von ihrer Spezies, der Konzentration und der Lokalisation unterschiedliche Toxizitäten aufweisen können. Die Speziation von Metallen wurde bisher mittels gängiger Analyseverfahren, wie der ICP-MS und ähnlicher Verfahren, anhand von bulk-Material durchgeführt. Durch die Entwicklung von optischen Sensoren für Metallionen war es möglich, diese Metalle auch in lebenden Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie zu lokalisieren. Ke und Kollegen (2006, 2007) nutzten einen solchen optischen Sensor - Newport Green DCF, um die Aufnahme von Nickel in humane A543 Lungenbronchialepithelzellen nach Inkubation mit dem wasserlöslichen NiCl2 (0,5 mM und 1 mM) sowie den wasserunlöslichen Verbindungen Ni3S2 (0,5 µg/cm2 und 1 µg/cm2) und NiS (2,5 µg/cm2) nachzuweisen und zu lokalisieren und konnten damit eine Akkumulation von Nickel im Zytoplasma und im Zellkern aufzeigen. Dabei war bei wasserlöslichen und wasserunlöslichen Nickelverbindungen Nickel nach 24 h im Zytoplasma und erst nach 48 h im Zellkern zu beobachten.rnrnDa Nickel und Cobalt keine detektierbare Eigenfluoreszenz unter den gegebenen Bedingungen zeigten, wurde für den optischen Nachweis von Nickel und Cobalt mit dem konfokalen Laser-Raster Mikroskop (CLSM) nach der Zugabe der verschiedenen wasserlöslichen und wasserunlöslichen Metallverbindungen NiCl2, NiSO4, Ni3S2 und CoCl2 in einzelnen lebenden humanen Gingiva-Fibroblasten, sowie in Pflanzenzellen in dieser Arbeit ebenfalls der optische Sensor Newport Green DCF genutzt. Korrespondierend zu den Ergebnissen früherer Arbeiten von Ke et al. (2006, 2007), in denen die Nickelaufnahme bei Konzentrationen von >0,5 mM NiCl2 bzw. >0,5 µg/cm2 Ni3S2 gezeigt wurde, wurde Nickel in Fibroblasten in Abhängigkeit von der Spezies mit steigender Metallkonzentration von 100 µM bis 500 µM nach 16 h im Zytoplasma und zunehmend nach 24 h bis 48 h im Zellkern detektiert. Bei der wasserunlöslichen Verbindung Ni3S2 war der Nachweis von Nickel im Zellkern bereits nach 16 h bis 24 h erfolgreich. Zusätzlich wurden weitere Strukturen wie das Endoplasmatische Retikulum, die Mitochondrien und die Nukleoli durch eine starke Fluoreszenz des optischen Sensors bei Colokalisationsexperimenten mit Organell-spezifischen Fluoreszenzfarbstoffen als target für die Nickelbindung vermutet. Die Lokalisation von Cobalt in den Fibroblasten entsprach weitgehend der Lokalisation von Nickel. Im Zellkern war die Cobaltlokalisation jedoch auf die Nukleoli beschränkt. Weiterführende Versuche an humanen Gingiva-Fibroblasten zeigten, dass die Aufnahme der Metalle in die Fibroblasten pH-Wert abhängig war. Niedrige pH-Werte im sauren pH-Bereich verringerten die Aufnahme der Metalle in die Zellen, wobei ein pH-Wert im basischen Bereich keinen bedeutenden Unterschied zum neutralen pH-Bereich aufwies. Im Vergleich zu den Fibroblasten war in Pflanzenzellen zu jedem Zeitpunkt, auch bei geringen Konzentrationen der Metallverbindungen sowie des optischen Sensors, Nickel und Cobalt in den Zellkernen detektierbar. Durch die Eigenschaft der Pflanzenzellen eine Vakuole zu besitzen, war Nickel und Cobalt hauptsächlich in den Vakuolen lokalisiert. Weitere Strukturen wie das Endoplasmatische Retikulum, die Mitochondrien oder auch die Zellwand kamen bei Pflanzenzellen als target in Frage.rnrnDie Fluoreszenz und Lokalisation der Metalle in den Fibroblasten waren unabhängig von der Spezies sehr ähnlich, sodass in den Zellen die Spezies anhand der fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen kaum unterschieden werden konnten. Lambda-Scans in verschiedenen regions of interest (ROI) wurden durchgeführt, um durch die Fluoreszenzspektren Hinweise auf eine charakteristische Beeinflussung der Bindungspartner von Nickel und Cobalt oder dieser Metalle selbst in den Zellen auf den optischen Sensor zu bekommen und diese dadurch identifizieren zu können. Das Ziel der parallelen Detektion bzw. Lokalisation und gleichzeitigen Speziation bestimmter Nickel- und Cobaltpezies in einzelnen lebenden Zellen konnte in dieser Arbeit durch den optischen Sensor Newport Green DCF nicht erreicht werden. Transition metals like nickel and cobalt are very important cofactors in enzymes or metall complexes. Distinct transition metals are essential for the metabolism of nearly all organisms. Because of their efficiency at lowest concentrations, a constant level of transitions metals is aspired. The consequence of an accumulation of transition metals for humans or plants depends on the species, the concentration and the localization inside the cell. Common analytical methods in metal speciation like the ICP-MS use bulk material, but the development of optical probes for transition metals allows the detection of metals in living cells by fluorescence microscopy. Newport Green DCF is one of these optical sensors which allows Ke and colleagues (2006, 2007) to detect nickel in the cytoplasm and the nucleus of human lung bronchoepithelial A543 cells after the incubation with the water soluble NiCl2 (0,5 mM und 1 mM) and the water unsoluble Ni3S2 (0,5 µg/cm2 und 1 µg/cm2) and NiS (2,5 µg/cm2). Nickel was detected in the cytoplasm after 24 h and first after 48 h in the nucleus in both water soluble and water unsoluble nickel species.rnrnBecause of non-detectable auto fluorescence of nickel and cobalt under the given conditions the optical probe Newport Green DCF was also used to detect nickel and cobalt in single living human gingiva fibroblasts and plant cells with confocal laser scanning microscopy (CLSM) after addition of the different water soluble and insoluble heavy metal species NiCl2, NiSO4, Ni3S2 and CoCl2. Corresponding to results from Ke and colleagues (2006, 2007), where the nickel uptake at concentrations of >0,5 mM NiCl2 respectively >0,5 µg/cm2 Ni3S2 was described, nickel was detected in the cytoplasm and the nucleus after 24 h up to 48 h according to the species, enhanced metal concentration (100 µM up to 500 µM) and incubation time. The incubation with the water soluble species Ni3S2 resulted in nickel detection in the nucleus after 16 h up to 24 h. Additionally, the endoplasmic reticulum, the mitochondria and the nucleoli are considered to be targets for nickel binding. The localization of cobalt in the fibroblasts is nearly identical with the localization of nickel beside the nucleus, where cobalt is limited to the nucleolus. Further experiments on human gingiva fibroblasts indicate a pH dependent uptake of metals in human cells. At acidic pH values the heavy metal uptake decreases in contrast to alkaline pH values, where there are no differences compared to neutral pH value. In comparison to fibroblasts nickel and cobalt in plant cells are detectable in the nucleus at early incubation times and even at low metal and dye concentrations. Additionally a main part of nickel and cobalt are localized in the vacuoles and further structures like the endoplasmic reticulum, mitochondria or the cell wall are considered to be targets for nickel and cobalt binding in plant cells too.rnrnThe fluorescence and the localization of the transition metals nickel and cobalt in fibroblasts are similar, independent of the species, so the species can rarely be distinguished by confocal laser scanning microscope (CLSM) images. For that reason lambda-scans in different regions of interest (ROI) inside a cell were accomplished to get hints for a characteristic influence of the binding complexes of nickel and cobalt or of these metals itself to the optical probe to identify different species or complexes. The objective of parallel localization and speciation of nickel and cobalt in single living cells could not be achieved.rnrnrn
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1768
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-35521
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	191 S.
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