Autoren:	Isbert, Simone
Titel:	Cellular localization and mechanism of amyloid precursor protein (APP) homodimer formation in an oxidizing environment
Online-Publikationsdatum:	13-Feb-2012
Erscheinungsdatum:	2012
Sprache des Dokuments:	Englisch
Zusammenfassung/Abstract:	The amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane glycoprotein, which resembles a cell surface receptor, comprising a large ectodomain, a single spanning transmembrane part and a short C-terminal, cytoplasmic domain. It belongs to a conserved gene family, with over 17 members, including also the two mammalian APP homologues proteins APLP1 and APLP2 („amyloid precursor like proteins“). APP is encoded by 19 exons, of which exons 7, 8, and 15 can be alternatively spliced to produce three major protein isoforms APP770, APP751 and APP695, reflecting the number of amino acids. The neuronal APP695 is the only isoform that lacks a Kunitz Protease Inhibitor (KPI) domain in its extracellular portion whereas the two larger, peripheral APP isoforms, contain the 57-amino-acid KPI insert. rnRecently, research effort has suggested that APP metabolism and function is thought to be influenced by homodimerization and that the oligomerization state of APP could also play a role in the pathology of Alzheimer's disease (AD), by regulating its processing and amyloid beta production. Several independent studies have shown that APP can form homodimers within the cell, driven by motifs present in the extracellular domain, as well as in the juxtamembrane (JM) and transmembrane (TM) regions of the molecule, whereby the exact molecular mechanism and the origin of dimer formation remains elusive. Therefore, we focused in our study on the actual subcellular origin of APP homodimerization within the cell, an underlying mechanism, and a possible impact on dimerization properties of its homologue APLP1. Furthermore, we analyzed homodimerization of various APP isoforms, in particular APP695, APP751 and APP770, which differ in the presence of a Kunitz-type protease inhibitor domain (KPI) in the extracellular region. In order to assess the cellular origin of dimerization under different cellular conditions, we established a mammalian cell culture model-system in CHO-K1 (chinese hamster ovary) cells, stably overexpressing human APP, harboring dilysine based organelle sorting motifs at the very C-terminus [KKAA-Endoplasmic Reticulum (ER); KKFF-Golgi]. In this study we show that APP exists as disulfide-bound, SDS-stable dimers, when it was retained in the ER, unlike when it progressed further to the cis-Golgi, due to the KKFF ER exit determinant. These stable APP complexes were isolated from cells, and analyzed by SDS–polyacrylamide gel electrophoresis under non-reducing conditions, whereas strong denaturing and reducing conditions completely converted those dimers to monomers. Our findings suggested that APP homodimer formation starts early in the secretory pathway and that the unique oxidizing environment of the ER likely promotes intermolecular disulfide bond formation between APP molecules. We particularly visualized APP dimerization employing a variety of biochemical experiments and investigated the origin of its generation by using a Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) approach with split GFP-APP chimeras. Moreover, using N-terminal deletion constructs, we demonstrate that intermolecular disulfide linkage between cysteine residues, exclusively located in the extracellular E1 domain, represents another mechanism of how an APP sub-fraction can dimerize within the cell. Additionally, mutational studies revealed that cysteines at positions 98 and 105, embedded in the conserved loop region within the E1 domain, are critical for interchain disulfide bond formation. Using a pharmacological treatment approach, we show that once generated in the oxidative environment of the ER, APP dimers remain stably associated during transport, reaching the plasma membrane. In addition, we demonstrate that APP isoforms, encompassing the KPI domain, exhibit a strongly reduced ability to form cis-directed dimers in the ER, whereas trans-directed cell aggregation of Drosophila Schneider (S2)-cells was isoform independent, mediating cell-cell contacts. Thus, suggesting that steric properties of KPI-APP might be the cause for weaker cis-interaction in the ER, compared to APP695. Finally, we provide evidence that APP/APLP1 heterointeractions are likewise initiated in the ER, suggesting a similar mechanism for heterodimerization. Therefore, dynamic alterations of APP between monomeric, homodimeric, and possibly heterodimeric status could at least partially explain some of the variety in the physiological functions of APP.rn Das Amyloid Vorläufer Protein („amyloid precursor protein“, APP) ist ein Typ I integrales Membranprotein, welches strukturelle Ähnlichkeiten mit Zelloberflächenrezeptoren aufweist. Es umfasst einen großen N-terminalen extrazellulären Abschnitt, einen Transmembranbereich, sowie einen kurzen cytoplasmatischen C-Terminus im Innern der Zelle. APP ist Teil einer konservierten Genfamilie mit insgesamt 17 Mitgliedern, zu denen auch die beiden Säuger-APP-homologen APLP1 und APLP2 („amyloid precursor like proteins“) gehören. Es wird von insgesamt 19 Exons codiert, von denen die Exons 7, 8 und 15 alternativ gespleißt werden können um die drei Hauptisoformen APP695, APP751 und APP770 zu generieren. Dabei ist APP695 die einzige Isoform ohne eine Kunitz Protease Inhibitor (KPI) Domäne, wobei die längeren, peripheren Isoformen über das 57 Aminosäuren lange Insert verfügen. rnAnhand mehrerer Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass APP Moleküle mittels der Ektodomäne oder der Transmembransequenz Homodimere in der Zelle ausbilden, wodurch die Prozessierung und Amyloid beta Produktion beeinflusst werden können. Jedoch sind der exakte molekulare Mechanismus sowie der zelluläre Ursprung noch weitgehend unbekannt. Daher sollten in der folgenden Studie vor allem das subzelluläre Kompartiment der Dimerbildung, ein zugrunde liegender Mechanismus im Hinblick auf die unterschiedlichen Isoformen, sowie eine mögliche Auswirkung auf Heterooligomerisierung mit dem homologen Protein APLP1 untersucht werden. Um zunächst das physiologische Kompartiment zu identifizieren, in welchem die APP Dimerisierung initiiert werden kann, wurde ein Zellkultur Modell-System etabliert. Dazu wurden CHO-K1 (Chinese Hamster Ovary) stabil mit humanem APP transfiziert, welches am C-Terminus mit Dilysin-Retentionsmotiven fusioniert wurde (KKAA für Retention im ER und KKFF für Retention im cis-Golgi), um eine Zurückhaltung von APP im frühen sekretorischen Weg zu erzielen. In der Arbeit wurde gezeigt, dass APP sobald es im ER zurückgehalten wurde, in Form von SDS-stabilen Dimeren aus Zellextrakten isoliert werden konnte, welche über kovalente intermolekulare Disulfidbrücken verbunden waren. Ein Weitertransport des APP-KKFF Fusionsproteins im sekretorischen Weg zum cis-Golgi Kompartiment, zeigte keine vergleichbare Dimerbilung. Diese stabilen APP Komplexe konnten unter Standard-Detergenzbedingungen aus Zellen isoliert und mit Hilfe von nicht-reduzierender SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt werden, wobei stark denaturierende, sowie reduzierende Bedingungen diese Dimere komplett zu Monomeren auflösten. Dadurch konnte gezeigt werden, dass die Oligomerisierung von APP schon sehr früh im sekretorischen Weg stattfindet, wobei das oxidierende Milieu des ER die Ausbildung von intermolekularen Disulfidbrücken zwischen benachbarten APP Molekülen fördert. Des Weiteren wurde die Dimerbildung mit Hilfe verschiedener biochemischer Methoden untersucht und die zelluläre Lokalisation ihrer Generierung zusätzlich durch Anwendung einer split-GFP Methode (BiFC, Bimolecular Fluorescence Complementation) mit APP-GFP Fusionsproteinen ermittelt. Durch biochemische Analysen von N- terminalen Deletionsmutanten konnte gezeigt werden, dass intermolekulare Disulfidbrücken zwischen Cystein Resten, welche ausschließlich in der extrazellulären E1 Domäne des APP695 präsent sind, einen möglichen Mechanismus repräsentiert wie ein Teil des zellulären APP dimerisieren kann. Mit Hilfe weiterer Mutationsanalysen konnte gezeigt werden, dass die Cysteine an Position 98 und 105 der konservierten Loop Region innerhalb der E1 Domäne entscheidend an der kovalenten intermolekularen Homodimerisierung von APP beteiligt sind. Durch die Anwendung von pharmakologischen Substanzen, welche gezielt mit dem frühen sekretorischen Weg oder der Clathrin-vermittelten Endozytose interferieren, konnte gezeigt werden, dass APP Dimere zwar in frühen Kompartimenten generiert werden, jedoch weiter innerhalb der Zelle bis hin zur Plasmamembran transportiert und vollständig glykosyliert werden. Darüber hinaus konnte demonstriert werden, dass APP KPI-Isoformen eine stark reduzierte Tendenz zur cis-Dimerisierung im ER aufweisen, wohingegen die trans-Dimerisierung an der Zelloberfläche von Drosophila Schneider (S2)-Zellen Isoform unabhängig ist, wodurch die Ausbildung von Zell-Zell-Kontakten vermittelt wird. Demnach könnten strukturelle Eigenschaften der KPI Domäne einen inhibitorischen Effekt auf die cis-Interaktion von APP751 oder APP770 im ER darstellen. Zudem zeigen unsere Ergebnisse dass eine Heterointeraktion von APP und APLP1 ebenfalls schon im ER initiiert wird und dass APP einen Teil des APLP1 im frühen sekretorischen Weg zurückhalten kann. Daher könnten dynamische Änderungen zwischen monomerem, homodimerem und heterodimerem Status zumindest einige der unterschiedlichen physiologischen APP Funktionen erklären.rnrn
DDC-Sachgruppe:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Veröffentlichende Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Organisationseinheit:	FB 10 Biologie
Veröffentlichungsort:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1311
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-30470
Version:	Original work
Publikationstyp:	Dissertation
Nutzungsrechte:	Urheberrechtsschutz
Informationen zu den Nutzungsrechten:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Umfang:	123 S.
Enthalten in den Sammlungen:	JGU-Publikationen