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Autoren: Laufs, Tilmann Lambert
Titel: Untersuchungen zur Expression und Lokalisation der respiratorischen Proteine Neuroglobin (Ngb) und Cytoglobin (Cygb) in Säugern
Online-Publikationsdatum: 1-Dez-2010
Erscheinungsdatum: 2010
Sprache des Dokuments: Deutsch
Zusammenfassung/Abstract: Die vorliegende Dissertation beinhaltet Untersuchungen zur Expression und Funktion der respiratorischen Proteine Neuroglobin (Nbg) und Cytoglobin (Cygb) in Vertebraten. rnrnUm die Expression der Globine während der Entwicklung des Säugerhirns zu untersuchen, wurden die Hirne von Maus-Embryonen ab dem Fötalstadium MF10 bis zum Tag eins nach der Geburt (T1) mit Adulttieren verglichen. Quantifiziert wurde sowohl die mRNA- als auch die Protein-Expression. Beide Globine zeigten im Verlauf der Entwicklung einen stetigen Anstieg der mRNA-Expression, wobei Ngb zu Beginn in zehnfach höherer Konzentration vorlag und im zeitlichen Verlauf einen 130-fachen Anstieg zeigte. Cygb zeigte lediglich einen 16-fachen Anstieg bis zum Adultstadium. Auf Proteinebene konnte die Expressionszunahme beider Globine im Laufe der Entwicklung bestätigt werden. Weder in den hypoxieresistenten Frühembryonalstadien noch während der mit Sauerstoff-Stress verbundenen Geburt zeigte sich ein Expressionsmaximum. Dies spricht gegen eine Globin-Funktion in der Oxidanz-Abwehr. Eher ist zumindest Ngb mit der Reifung der Neurone und dem damit einhergehenden, gesteigerten oxidativen Stoffwechsel assoziiert.rnrnDes Weiteren sollte die zelluläre und intrazelluläre Lokalisation beider Globine anhand einer primären Zellkultur aus dem Hippocampus pränataler Ratten und in immortalen Zelllinien untersucht werden. Neuroglobin wurde dabei nur in Neuronen, nicht jedoch in Gliazellen nachgewiesen. Das Färbemuster war in allen Ngb-exprimierenden Zellen zytoplasmatisch. Cytoglobin wurde in der Primärkultur in den Neuronen jedoch ebenso in den mit anti-GFAP markierten Gliazellen beobachtet. In beiden Zellpopulationen war auch der Kern durch das CyGB-Antiserum markiert. rnEine genauere Untersuchung der intrazellulären Lokalisation sollte durch die Transfektion von Globin-pEGFP- Fusionsproteinen erfolgen. Nach Transfektion der Fusionskonstrukte wurde die GFP-Färbung bei beiden Globinen sowohl im Zytoplasma als auch im Kern beobachtet. Eine rein nukleäre Lokalisation, die insbesondere für Cygb von anderen Autoren postuliert wurde, konnte somit ausgeschlossen werden. rnrnIn primären Zellkulturen aus Cerebellum und Kortex, die mit Hilfe von Paraquat oxidativem Stress ausgesetzt wurden, wurde der Verlauf der Globin-mRNA-Expression mit dem unregulierten 18s rRNA-Referenzgen und mit den Antioxidanz-Enzymen Cu-Zn-SOD und Gpx verglichen. Neuroglobin zeigte einen Expressionsverlauf ähnlich dem der beiden Antioxidanz-Enzyme, jedoch liegt seine mRNA im Hirngewebe in hundertfach niedrigerer Menge als Cu-Zn-SOD und Gpx vor. Cytoglobin zeigte keine Veränderung der Expression. Eine Funktion der Globine im Sinne einer ROS-Abwehr kann aus den Befunden nicht abgeleitet werden. rnrnUntersuchungen von Tumor und Normalgewebe mittels eines cDNA-Cancer-Arrays zeigten, dass NGB in Tumoren verschiedenen Ursprungs nicht exprimiert wird, CyGB dagegen keine Änderung seiner Expression in Tumor versus Normalgewebe erfährt. Eine Induktion der beiden Globine z.B. durch Hypoxie in soliden Tumoren kann daher ausgeschlossen werden.rn
The dissertation at hand contains investigations on expression and function of the respiratory proteins Neuroglobin (Ngb) and Cytoglobin (Cygb) in vertebrates. rnrnFor investigation of the expression of both globines during development of the mammalian brain, brains of mice-embryo from foetal state MF10 to day1 after birth (T1) were compared to brains from adult animals. Therefore the mRNA and protein-expression were quantified. For both globines a continuous increase was detectable during development of the brain. Expression of Ngb mRNA was 10-fold higher at the first time point investigated and was increased 130-fold until T1. For Cygb there was only a 16-fold increase in mRNA expression detectable from prenatal to adult-state. Results from protein-expression showed also an increase of both globines during development. A significant maximum of globine-expression wasn’t detectable during hypoxia-resistant embryonic-states nor during hypoxic-stress inducing birth. This points out a globine-function apart from defending oxidative stress. Ngb seems to be associated with maturation of neurons and the coherent enriched oxidative metabolism. rnrnFurthermore the cellular and intercellular localization of both globines was analyzed in primary cells prepared from the hippocampus of prenatal rats and in immortalized celllines. Detection of Ngb was successful only in neurons but not in glia-cells. All Ngb-positive cells show the same cytoplasmic staining-pattern. Neurons of the primary culture of prenatal rat hippocampus were also detected to be Cygb-positive. Also GFAP-labeled glia-cells showed a positive Cygb-staining. In both cell populations the nucleus and the cytoplasm were labeled by the Cygb-antiserum.rnrnAdditionally, the intracellular localization was analyzed using eGFP-tagged globine-expression vectors. Transfection of eukaryotic cells with the globine-GFP constructs yielded in a GFP signal in the cytoplasm as well as the nucleus. Hence, a pure nuclear localization as suggested by other authors could now be excluded.rnrnmRNAs from primary cell cultures of cerebellum and cortex, treated with paraquat to induce oxidative stress, were analyzed for globine-mRNA-expression versus 18s rRNA as non-regulated reference and antioxidant enzymes Cu-Zn-SOD and Gpx. Expression of Ngb was detected to be similar to that of the antioxidant enzymes. Of note the Ngb was found to be expressed 100-fold lower than Cu-Zn-SOD and Gpx. There was no change of Cygb-expression detectable during prolonged hypoxic stress induction. For both globines a function in ROS-defense can not be concluded.rnrnComparison of tumor and healthy tissue with a cDNA-cancer-array revealed NGB not to be expressed in different tumor-types nor healthy tissue. CyGB could be detected in tumor and healthy tissue but there was no change in expression detectedable. Induction of expression of both globines during hypoxic conditions in tumor tissue can thus be excluded.rn
DDC-Sachgruppe: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Veröffentlichende Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Organisationseinheit: FB 10 Biologie
Veröffentlichungsort: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1008
URN: urn:nbn:de:hebis:77-24590
Version: Original work
Publikationstyp: Dissertation
Nutzungsrechte: Urheberrechtsschutz
Informationen zu den Nutzungsrechten: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Umfang: 188 S.
Enthalten in den Sammlungen:JGU-Publikationen

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